Distrofia muscular congênita merosina negativa: um relato de caso / Congenital muscular dystrophy merosin negative: a case report

A Distrofia muscular laminin subunit alpha 2 (DM LAMA2) é caracterizada pela deficiência da proteína da cadeia laminina α2, apresentando sintomas distróficos que progridem na infância. Objetivo: Apresentar dados da avaliação fisioterapêutica de uma criança com DM LAMA2 em acompanhamento ambulatorial. Métodos: Pesquisou-se em prontuário dados referentes às avaliações fisioterapêuticas de uma criança de 12 anos com diagnóstico de DM LAMA2 atendida em ambulatório especializado. A avaliação caracterizou-se por ausculta pulmonar, espirometria, verificação de parâmetros cardiorrespiratórios, análise do pico de fluxo de tosse (PFT), força muscular respiratória (FMR) e avaliação motora através da escala MFM-32. Resultados: Realizou-se três avaliações durante 9 meses. A paciente possui doença pulmonar restritiva, na primeira avaliação apresentou VEF1= 29% na espirometria e, comparando com a terceira avaliação obteve aumento de 1%, também houve aumento de 2% na relação VEF1/CVF, 5% no PEF e 11% no FEF25-75%. Na FMR, obteve-se valores de PImáx= 17,9% e PEmáx= 7,13% na primeira avaliação com aumento de 16,85% e 5,34% respectivamente, entre primeira e terceira avaliação. O PFT manteve-se em 0L/min em todas avaliações. Na primeira avaliação motora pontuou 25% no escore total da escala MFM-32, aumentando 3,12% na terceira avaliação. Ao longo do acompanhamento iniciou-se o uso da VNI noturna e introduzida a técnica de AS, buscando correção da hipoxemia, apneias noturnas, aumento do PFT e FMR. Conclusão: Paciente apresentou manutenção de parâmetros espirométricos, aumento de variáveis de FMR e função motora, sem piora do quadro. Possíveis resultados decorridos do acompanhamento multiprofissional e especializado.

Laminin subunit alpha 2 muscular dystrophy (DMLAMA2) is characterized by a deficiency of the α2 laminin chain protein, presenting dystrophic symptoms that progress in childhood. Objective: To present data from the physical therapy evaluation of a child with DMLAMA2 in outpatient follow-up. Methods: Medical records were searched for data referring to the physiotherapeutic evaluations of a 12-year-old child diagnosed with DMLAMA2 treated at a specialized outpatient clinic. The evaluation was characterized by pulmonary auscultation, spirometry, verification of cardiorespiratory parameters, analysis of peak cough flow (PFT), respiratory muscle strength (FMR) and motor evaluation using the MFM-32 scale. Results: Three evaluations were carried out during 9 months. The patient has restrictive disease, in the first evaluation she had FEV1= 29% in spirometry, compared to the third evaluation, she had an increase of 1%, there was also an increase of 2% in the FEV1/FVC ratio, 5% in the PEF and 11% in the FEF25-75%. In the FMR, values of MIP=17.9% and MEP= 7.13% were obtained in the first assessment, with an increase of 16.85% and 5.34%, respectively, between the first and third assessments. The PFT remained at 0L/min in all evaluations. In the first motor evaluation, it scored 25% in the total score of the MFM-32 scale, increasing 3.12% in the third evaluation. During the follow-up, the use of nocturnal NIV started and AS technique was introduced, seeking correction of hypoxemia, night apneas, increased PFT and FMR. Conclusion: Patient presented maintenance of spirometric parameters, increased FMR variables and motor function, without worsening the condition. Possible results from the multidisciplinary and specialized monitoring.

Effects of ultrasound and stretching on skeletal muscle contusion in rats: immunohistochemistry analysis / Efectos de ultrasonido y estiramiento en la contusión muscular esqueletal en ratas: análisis inmunohistoquímico

SUMMARY: The aim of this study was to evaluate the effects of stretching and therapeutic ultrasound (TUS) on desmin and laminin contents of rat muscle after contusion. Male Wistar rats (n = 35, 8-9 weeks of age, 271 ± 14g body weight) were divided into five groups: Control group (CG) (n= 03); Injured group (IG) (n= 8); Injured + ultrasound group (IUSG) (n= 8); Injured+stretching group (ISG) (n= 8); Injured +ultrasound + stretching group (IUSSG) (n= 8). The application of ultrasound started 72 hours after the contusion, using the 50 % pulsed mode, 0.5 W/cm2, 5 min, once a day, for five consecutive days. Passive manual stretching was started on the tenth day after injury, with four repetitions of 30 s each and 30 s rest between repetitions, once a day, five times per week, for a total of ten applications. After 22 days, the rats were euthanazied and the gastrocnemius of both limbs removed for desmin and laminin immunohistochemistry morphometric measurement. Analysis was conducted using ANOVA one way post-hoc Tukey to parametric data and Kruskall-Wallis for non-parametric data. The IUSSG animals showed a larger area of desmin than ISG (p<0.05). It was found a decrease in laminin comparing IUSG to IG. However, laminin area was higher in ISG than all groups (p<0.05). UST isolated or in combination with stretching influenced gastrocnemius regeneration in different manners. While stretching applied isolated enhanced gastrocnemius regeneration noticed by the increase in laminin area, in combination with TUS strengthened the muscle healing rising desmin area.

RESUMEN: El objetivo de este estudio fue evaluar los efectos del estiramiento y la ecografía en los contenidos de desmina y laminina del músculo de rata después de la lesión. Ratas Wistar macho (n = 35, 8-9 semanas de edad, 271 ± 14 g de peso corporal) se dividieron en cinco grupos: grupo de control (CG) (n = 03); Grupo lesionado (GL) (n = 8); Lesionado + grupo de ultrasonido (LGU) (n= 8); Lesionado + grupo de estiramiento (LGE) (n = 8); Lesionado + ultrasonido + grupo de estiramiento (LUGE) (n = 8). La aplicación de ultrasonido comenzó 72 horas después de la lesión, usando el modo pulsado al 50 %, 0,5W / cm2, 5 min, una vez al día, durante cinco días consecutivos. El estiramiento manual pasivo se inició el décimo día después de la lesión, con cuatro repeticiones de 30 seg cada una y 30 seg de descanso entre repeticiones, una vez al día, cinco veces por semana, para un total de diez aplicaciones. Las ratas fueron sacrificadas después de 22 días, y se extrajo el músculo gastrocnemio de ambos miembros para la medición morfométrica de desmina y laminina a través de inmunohistoquímica. El análisis se realizó utilizando ANOVA unidireccional Tukey post-hoc para datos paramétricos y Kruskall-Wallis para datos no paramétricos. Los animales LUGE mostraron un área mayor de desmina que LGE (p <0,05). Se encontró una disminución en la laminina comparando LGU con GL. Sin embargo, el área de laminina fue mayor en LGE que en todos los grupos (p <0,05). El tratamiento con ultrasonido aislado o en combinación con estiramiento influyó en la regeneración del músculo gastrocnemio de diferentes maneras. Si bien el estiramiento aplicado, en combinación con tratamiento de ultrasonido, fortaleció el área de desmina, la regeneración del músculo gastrocnemio mejoró por el aumento en el área de laminina aumentando la curación muscular.

Terapias alternativas para o diabetes mellitus tipo 1: caracterização funcional do gene Txnip na diferenciação ß-pancreática e desenvolvimento de biomaterial inovador para microencapsulamento celular / Alternative therapies for type 1 diabetes mellitus: functional characterization of Txnip gene during -pancreatic differentiation and generation of an innovative biomaterial for cell microencapsulation

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença causada pela destruição autoimune das células-ß produtoras de insulina do pâncreas. O transplante de ilhotas pancreáticas é um procedimento tecnicamente simples sendo uma alternativa terapêutica interessante para o DM1. Entretanto, a oferta limitada de pâncreas de doadores falecidos e a necessidade de imunossupressão crônica são fatores que limitam a aplicabilidade dessa modalidade de transplante. Neste trabalho foram estudadas duas estratégias que visam oferecer soluções aos fatores limitantes do transplante de ilhotas pancreáticas. Na primeira parte do trabalho, o mecanismo molecular que dirige o processo de diferenciação de células-tronco embrionárias murinas (murine embryonic stem cells, mESCs) em células produtoras de insulina (insulin producing cells, IPCs) foi analisado visando otimizar o processo de diferenciação. Nós selecionamos o gene Thioredoxin interacting protein (Txnip), diferencialmente expresso ao longo da diferenciação ß-pancreática, para realizar um estudo funcional através da modificação genética de mESCs. Os resultados obtidos permitiram verificar que a inibição de Txnip na diferenciação ß-pancreática pode induzir a diferenciação de IPCs com maior expressão de marcadores de células- e mais responsivas ao estímulo de glicose. Além disso, o modelo de zebrafish permitiu elucidar in vivo o papel de Txnip durante a organogênese pancreática, revelando que a inibição desse gene é capaz de aumentar a massa de células-ß através do estimulo de células presentes no ducto extra-pancreático. Dessa forma, a inibição de Txnip pode aprimorar os protocolos para obtenção de IPCs a partir de células-tronco pluripotentes. A exposição crônica a agentes imunossupressores diabetogênicos e a perda de componentes de matriz extracelular durante o isolamento de ilhotas pancreáticas são causas para a perda de funcionalidade do enxerto. Dessa forma, na segunda parte do trabalho, um biomaterial inovador foi desenvolvido, contendo um polímero de laminina (polilaminina, PLn) para o encapsulamento e a imunoproteção de ilhotas pancreáticas. As cápsulas produzidas com o biomaterial desenvolvido, Bioprotect-Pln, são térmica- e mecanicamente estáveis, além de serem biocompatíveis e capazes de imunoproteger ilhotas pancreáticas humanas in vitro. O encapsulamento com Bioprotect-Pln preserva a funcionalidade de ilhotas pancreáticas. Além disso, quando cápsulas vazias de Bioprotect-Pln foram implantadas em camundongos imunocompetentes, houve atenuação da resposta inflamatória ao implante, uma das principais causas para perda de funcionalidade de enxertos encapsulados. Os resultados obtidos indicam que a presença de polilaminina na malha capsular induz uma resposta anti-inflamatória que pode beneficiar a preservação do enxerto de ilhotas pancreáticas encapsuladas. Atualmente, o transplante de ilhotas pancreáticas é visto como a terapia celular mais promissora para atingir a independência de insulina em pacientes de DM1, porém, a aplicabilidade desse transplante ainda é limitada. Este trabalho contribuiu para a elucidação dos mecanismos moleculares que podem aprimorar o processo de diferenciação de célulastronco pluripotentes em IPCs, estabelecendo uma fonte alternativa de células para a terapiade reposição, e, também, estabeleceu um biomaterial inovador, capaz de diminuir a resposta inflamatória ao implante de microcápsulas e de imunoproteger células microencapsuladas. Desta forma, este trabalho contribui para o estabelecimento da terapia de reposição celular para pacientes de DM1

Type 1 diabetes mellitus (DM1) is a disease caused by the autoimmune destruction of insulin-producing pancreatic ß-cells. Pancreatic islet transplantation is a technically simple procedure and an interesting alternative therapy for DM1, however, the limited supply of cadaveric donated pancreas and the need of life-long immunosuppression are factors which limit its applicability. In the present work, two strategies were employed aiming at establishing viable solutions for the factors limiting pancreatic islet transplantation. In the first part of this study, the molecular mechanism which drives differentiation of murine embryonic stem cells (mESCs) into insulin producing cells (IPCs) was analyzed in order to optimize the differentiation process. The Thioredoxin interacting protein (Txnip) gene, which is differentially expressed along -pancreatic differentiation, was selected to undergo a functional analysis by genetically modifying mESCs. The results allowed us to verify that Txnip inhibition during the ß-pancreatic differentiation process can induce differentiation of IPCs displaying higher expression of ß-cell markers and being more responsive to glucose stimuli. In addition, the zebrafish model allowed us to elucidate in vivo the role of Txnip during pancreatic organogenesis, revealing that its inhibition is able to increase the mass of ß-cells through stimulation of extra-pancreatic ductal cells. Therefore, Txnip inhibition may turbinate IPCs differentiation from pluripotent stem cells. The chronic exposure to diabetogenic immunosuppressive agents and the loss of extracellular matrix components during isolation of pancreatic islets are probable causes for the loss of pancreatic islet graft functionality. Therefore, in the second part of this study, an innovative biomaterial was developed by incorporating a laminin polymer (polylaminin, PLn) for the encapsulation and immunoprotection of pancreatic islets. The capsules produced with the novel biomaterial, Bioprotect-Pln, are biocompatible, thermally and mechanically stable and are able to immunoprotect human pancreatic islets in vitro. Encapsulation with Bioprotect-Pln preserves the functionality of pancreatic islets. In addition, when empty Bioprotect-Pln capsules were implanted into immunocompetent mice, an attenuation of the inflammatory response to the implant occurred, this being one of the main causes of encapsulated graft loss. The results indicate that polylaminin addition to the capsular mesh induces an anti-inflammatory response which may favor preservation of the engrafted encapsulated pancreatic islets. Pancreatic islet transplantation is currently seen as the most promising cell therapy to achieve insulin independence in DM1 patients, however, the applicability of this transplant is still limited. This work contributed to the elucidation of the molecular mechanisms which can turbinate the differentiation of pluripotent stem cells into IPCs, establishing an alternative source of cells for the replacement therapy, and, also, established an innovative biomaterial which is able to decrease the inflammatory response to the graft, thereby immunoprotecting the microencapsulated cells. Therefore, this work contributes to the establishment of the cell replacement therapy for DM1 patients

Expressão da laminina 332 em vasos de carcinomas de células escamosas orais / Expression of laminin 332 in vessels of oral squamous cell carcinomas

Objetivo: Analisar expressão da cadeia γ2 da laminina 332 na membrana basal de vasos de carcinoma de células escamosas orais (CCE) e seu aspecto de continuidade para detecção de possíveis processos invasivos vasculares, importante evento na progressão da doença. Ainda, associar os aspectos clínicos do paciente e da lesão com os achados microscópicos. Material e Métodos: Foi realizada técnica imuno-histoquímica para detecção da cadeia γ2 da laminina 332 em 16 casos de CCE, sendo oito Bem Diferenciado e oito Moderadamente Diferenciado. Os aspectos microscópicos avaliados foram expressão da molécula na membrana basal de vasos e o seu aspecto de continuidade. Possíveis associações entre dados clínicos e achados microscópicos foram avaliadas. Resultados: Um total de 15 casos (93,75%) apresentaram vasos com expressão da cadeia γ2. Em CCE Bem Diferenciados, 85,71% das lesões apresentaram vasos com perda de continuidade da membrana basal, enquanto que em CCE Moderadamente Diferenciados 100% dos casos tiveram vasos com esse aspecto. Em relação às associações entre aspectos clínicos e integridade da membrana basal vascular, nos CCE Bem Diferenciados foram observadas correlações positivas da perda de continuidade com o gênero e idade acima de 60 anos (p < 0,0001). Para CCE Moderadamente Diferenciado, as associações foram com gênero masculino (p < 0,0001), hábito de fumar (p < 0,0001) e idade < 60 anos (p < 0,0001). Conclusão: Nossos dados sugerem que a expressão da cadeia γ2 em estruturas vasculares está presente em lesões de CCE e pode estar associada ao comportamento mais agressivo da doença.

Objective: 1) To analyze the γ2 chain expression of laminin 332 in the basement membrane of vessels of oral squamous cell carcinoma (OSCC), and the appearance of continuity, to identify possible vascular invasive procedures which are important events in the disease progression. 2) To examine the association between clinical aspects from patients and microscopic findings from lesions. Material and Methods: Immunohistochemistry was performed to detect γ2 chain of laminin 332 in 16 cases of OSCC; of which, eight were classified as being "Well Differentiated" and eight as being "Moderately Differentiated." Microscopic aspects were evaluated, including the expression of the molecule in the basement membrane of vessels and the appearance of continuity. Results: 15 cases (93.75%) showed vessels with γ2 chain expression. In OSCC defined as being "Well Differentiated," 85.71% of lesions presented with loss of vessel continuity of the basement membrane, whereas in OSCC defined as being "Moderately Differentiated," 100% of presented vessels with this aspect. Regarding associations between clinical aspects of patients and integrity of the vascular basement membrane, in OSCC defined as being "Well Differentiated," positive correlations were observed between loss of continuity and both gender and age >60 years (p < 0.0001). For OSCC defined as being "Moderately Differentiated," positive associations were observed for being male (p < 0.0001), currently smoking (p < 0.0001) and being <60 years old (p < 0.0001). Conclusion: Our data suggest that the γ2 chain expression in vascular structures is present in OSCC and is associated with more aggressive disease.

Collagen IV and laminin expression in squamous cellcarcinomas of lower lip and tongue / Expressão de colágeno IV e laminina em carcinomas de células escamosas de lábio inferior e língua

In this study, the expression of extra cellular matrix proteins was immunohisto chemically studied and compared with the histological grading of squamous cell carcinomas of the lower lip and tongue. Material and Methods: The lower lip carcinomas (n =12) and the tongue carcinomas (n = 12) were histopathologically graded according to Bryne’smethod. The immunohisto chemical technique used specific antibodies for collagen IV and laminin. Histopathological and immunohisto chemical analysis were carried-out at the invasive tumor front. Results: Most of the lower lip carcinomas(91.7%) were classified with lower scores and all tongue carcinomas (100%) with high-grade malignant scores (p < 0.01). Collagen type IV expression was absent in the peri tumoral basement membrane in 50% of lower lip carcinomas and in66. 7% of tongue carcinomas (p = 0.09). Laminin expression was absent in the peritumoral basement membrane in 66.7% of lower lip carcinomas and in 58.3% of tongue carcinomas (p = 0.48). When these two glycoproteins were expressed, they showed alinear, thin and discontinuous pattern and a weak intensity of expression. Conclusion: The high gradem alignancy score of the tongue carcinomas was associated with the pattern of expression of the matrix proteins studied. This suggested that tonguesquamous cell carcinomas have more invasive potential and more aggressive biological behaviorthan the lower lip carcinomas...

Neste estudo, a expressão das proteínas da matriz extracelular foi estuda da imunoisto quimicamente e comparada com a classificação histológica dos carcinomas de células escamosas do lábio inferior e língua. Material e Métodos: Os carcinomas de lábio inferior (n = 12)e os carcinomas de língua (n = 12) foram graduados histopatologicamente de acordo com o método de Bryne. A técnica de imunoistoquímica utilizou anticorpos específicos para colágeno IV e laminina. Análises histopatológica e imunoistoquímica foram conduzidas na frente invasiva tumoral. Resultados: A maioria dos carcinomas de lábio inferior (91,7%) foi classificada em baixo grau e todos os carcinomas de língua (100%) em alto grau de malignidade (p < 0,01). A expressão de colágeno tipo IV estava ausente na membrana basal peri tumoral em 50% dos carcinomas de lábio inferior e em 66,7% dos carcinomas de língua (p = 0,09). A expressão de laminina estava ausente na membrana basal peri tumoral em 66,7%dos carcinomas do lábio inferior e em 58,3% dos carcinomas de língua (p = 0,48). Quando estas duas glicoproteínas foram expressas, mostraram-se comum padrão linear, fino e descontínuo e uma fraca intensidade de expressão. Conclusão: O alto grau de malignidade dos carcinomas de língua associou-se com o padrão de expressão das proteínas de matriz estudadas. Isso sugere que carcinomas de células escamosas de língua têm comportamento biológico mais agressivo e potencial mais invasivo do que os carcinomas de lábio inferior...

Imunoproteção de ilhotas pancreáticas microencapsuladas em biomateriais inovadores e seu potencial terapêutico no diabetes mellitus tipo 1 / Immunoprotection of pancreatic islets microencapsulated in inovative biomaterials and its therapeutic potential in type 1 Diabetes Mellitus

O transplante de ilhotas microencapsuladas constitui uma alternativa terapêutica interessante para o Diabetes Mellitus tipo 1, permitindo um melhor controle glicêmico e eliminando a necessidade de imunossupressão. Entretanto, a manutenção a longo prazo da viabilidade das células-β ainda é um desafio. No isolamento, a perda da matriz extracelular e as condições hipóxicas subsequentes afetam decisivamente a sobrevivência e funcionalidade das ilhotas. Objetivo Para diminuir o estresse sobre o enxerto, levando a um sucesso prolongado do transplante, propôs-se a adição de perfluorocarbono (PFC) ou laminina (LN), moléculas associadas respectivamente à oxigenação e interações célula-célula, ao biomaterial baseado em alginato, Biodritina, adequado ao encapsulamento celular. Metodologia Para testar a estabilidade das formulações PFC-Biodritina e LN-Biodritina, microcápsulas foram submetidas a diferentes estresses (rotacional, osmótico, temperatura e cultura) por 7 e 30 dias. A pureza do biomaterial foi avaliada pela coincubação com macrófagos murinos RAW264.7, por 3, 9 e 24h, quando a ativação dos macrófagos foi observada pela expressão gênica de IL- 1β e TNFα. Microcápsulas implantadas i.p. em camundongos foram recuperadas após 7 ou 30 dias, para análises de biocompatibilidade. A expressão de níveis de mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulina 1 e 2), proteínas (Bax, Bcl-XL e Xiap) e a atividade de Caspase3 foram avaliadas em ilhotas microencapsuladas com PFC- e LN-Biodritina, após cultura de 48h em condições de normóxia e hipóxia (<2% O2). Camundongos diabéticos foram transplantados com ilhotas encapsuladas nas diferentes formulações e os animais foram monitorados pelas variações de massa corporal, glicêmicas e pela funcionalidade do enxerto (TOTGs). As ilhotas foram recuperadas de animais normo ou hiperglicêmicos e uma análise de biocompatibilidade das cápsulas foi realizada, assim como a avaliação funcional das células-β...

Transplantation of microencapsulated islets represents an attractive therapeutical approach to treat type 1 Diabetes Mellitus, accounting for an improved glycemic control and the abolishment of immunosuppressive therapies. However, maintenance of long-term β-cell viability remains a major problem. During islet isolation, the loss of extracellular matrix interactions and the hypoxic conditions thereafter dramatically affect β-cell survival and function. Objective To lessen the burden of islet stress and achieve a better outcome in islet transplantation we tested the addition of perfluorocarbon (PFC) or laminin (LN), molecules associated respectively with oxygenation and cell-cell interaction, to Biodritin, an alginate-based material suitable for cell microencapsulation. Methodology To test the stability of PFC-Biodritin and LN-Biodritin composites, microcapsules were subjected to different stresses (rotational, osmotic, temperature and culture) for 7 and 30 days. To assess biomaterial purity microcapsules were co-incubated with RAW264.7 murine macrophage cell line for 3, 9 and 24h and macrophage activation was detected through mRNA levels of IL-1β and TNFα. Microcapsules were implanted i.p. in mice and retrieved after 7 or 30 days, for biocompatibility analyses. Gene expression at mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulin 1 and 2) and protein (Bax, Bcl-XL and Xiap) levels, together with Caspase3 activity, were evaluated in islets microencapsulated in PFC- or LN-Biodritin, upon culturing for 48h in normoxic or hypoxic (<2% O2) conditions. Diabetic mice were transplanted with PFC- or LN-Biodritin microencapsulated islets, followed by assessments of body weight, glycemia and graft function by oral glucose tolerance tests (OGTTs). Microencapsulated islets were retrieved from normoglycemic or hyperglycemic mice and biocompatibility analyses of the beads together with a functional assessment of the graft followed. After graft...

Imunoproteção de ilhotas pancreáticas microencapsuladas em biomateriais inovadores e seu potencial terapêutico no diabetes mellitus tipo 1 / Immunoprotection of pancreatic islets microencapsulated in inovative biomaterials and its therapeutic potential in type 1 Diabetes Mellitus

O transplante de ilhotas microencapsuladas constitui uma alternativa terapêutica interessante para o Diabetes Mellitus tipo 1, permitindo um melhor controle glicêmico e eliminando a necessidade de imunossupressão. Entretanto, a manutenção a longo prazo da viabilidade das células-ß ainda é um desafio. No isolamento, a perda da matriz extracelular e as condições hipóxicas subsequentes afetam decisivamente a sobrevivência e funcionalidade das ilhotas. Objetivo Para diminuir o estresse sobre o enxerto, levando a um sucesso prolongado do transplante, propôs-se a adição de perfluorocarbono (PFC) ou laminina (LN), moléculas associadas respectivamente à oxigenação e interações célula-célula, ao biomaterial baseado em alginato, Biodritina, adequado ao encapsulamento celular. Metodologia Para testar a estabilidade das formulações PFC-Biodritina e LN-Biodritina, microcápsulas foram submetidas a diferentes estresses (rotacional, osmótico, temperatura e cultura) por 7 e 30 dias. A pureza do biomaterial foi avaliada pela coincubação com macrófagos murinos RAW264.7, por 3, 9 e 24h, quando a ativação dos macrófagos foi observada pela expressão gênica de IL- 1ß e TNFα. Microcápsulas implantadas i.p. em camundongos foram recuperadas após 7 ou 30 dias, para análises de biocompatibilidade. A expressão de níveis de mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulina 1 e 2), proteínas (Bax, Bcl-XL e Xiap) e a atividade de Caspase3 foram avaliadas em ilhotas microencapsuladas com PFC- e LN-Biodritina, após cultura de 48h em condições de normóxia e hipóxia (<2% O2). Camundongos diabéticos foram transplantados com ilhotas encapsuladas nas diferentes formulações e os animais foram monitorados pelas variações de massa corporal, glicêmicas e pela funcionalidade do enxerto (TOTGs). As ilhotas foram recuperadas de animais normo ou hiperglicêmicos e uma análise de biocompatibilidade das cápsulas foi realizada, assim como a avaliação funcional das células-ß. Após o explante, a glicemia dos animais normoglicêmicos foi monitorada para se atestar a eficiência das ilhotas transplantadas. Resultados Microcápsulas de PFC- e LN-Biodritina são tão estáveis e biocompatíveis quanto as de Biodritina. Para ilhotas encapsuladas em ambos os materiais, em normóxia ou hipóxia, observou-se uma modulação gênica que sugere proteção contra apoptose. Adicionalmente, encontrou-se uma diminuição na expressão de genes indicadores de estresse (mcp1, hsp70). Uma diminuição nos níveis de mRNA de ldh foi vista para PFC-Biodritina, mas o oposto foi encontrado para LN-Biodritina. As diferenças encontradas na expressão proteica sugerem o mesmo padrão anti-apoptótico. Caspase3 não foi modulada por nenhum biomaterial. Nos experimentos de transplante, apenas LN-Biodritina levou reversão prolongada do diabetes, com 60% dos animais normoglicêmicos, 198 dias pós-cirurgia, comparado a 9% do grupo Biodritina. O TOTG demonstrou que camundongos transplantados com ilhotas encapsuladas secretaram mais insulina do que controles, 60 (LN-Biodritina) ou 100 (PFC- e LN-Biodritina) dias pós-cirurgia. O explante restabeleceu a hiperglicemia nos camundongos. Microcápsulas recuperadas de animais hiperglicêmicos apresentavam uma extensa adesão celular. Testes de secreção de insulina in vitro demonstraram que somente ilhotas do grupo normoglicêmico responderam às variações da concentração de glicose. Conclusão A adição de moléculas bioativas à Biodritina é capaz de diminuir o estresse em ilhotas isoladas e tem o potencial de melhorar a terapia pelo transplante de ilhotas

Transplantation of microencapsulated islets represents an attractive therapeutical approach to treat type 1 Diabetes Mellitus, accounting for an improved glycemic control and the abolishment of immunosuppressive therapies. However, maintenance of long-term ß-cell viability remains a major problem. During islet isolation, the loss of extracellular matrix interactions and the hypoxic conditions thereafter dramatically affect ß-cell survival and function. Objective To lessen the burden of islet stress and achieve a better outcome in islet transplantation we tested the addition of perfluorocarbon (PFC) or laminin (LN), molecules associated respectively with oxygenation and cell-cell interaction, to Biodritin, an alginate-based material suitable for cell microencapsulation. Methodology To test the stability of PFC-Biodritin and LN-Biodritin composites, microcapsules were subjected to different stresses (rotational, osmotic, temperature and culture) for 7 and 30 days. To assess biomaterial purity microcapsules were co-incubated with RAW264.7 murine macrophage cell line for 3, 9 and 24h and macrophage activation was detected through mRNA levels of IL-1ß and TNFα. Microcapsules were implanted i.p. in mice and retrieved after 7 or 30 days, for biocompatibility analyses. Gene expression at mRNA (bax, bad, bcl-2, bcl-XL, xiap, caspase 3, mcp1/ccl2, hsp70, ldh, insulin 1 and 2) and protein (Bax, Bcl-XL and Xiap) levels, together with Caspase3 activity, were evaluated in islets microencapsulated in PFC- or LN-Biodritin, upon culturing for 48h in normoxic or hypoxic (<2% O2) conditions. Diabetic mice were transplanted with PFC- or LN-Biodritin microencapsulated islets, followed by assessments of body weight, glycemia and graft function by oral glucose tolerance tests (OGTTs). Microencapsulated islets were retrieved from normoglycemic or hyperglycemic mice and biocompatibility analyses of the beads together with a functional assessment of the graft followed. After graft removal, normoglycemic animals had their glycemias monitored to attest the efficacy of the transplanted islets. Results PFC- and LN-Biodritin microcapsules were as stable and biocompatible as Biodritin. For both biomaterials in normoxia and hypoxia a modulation in gene expression was observed in islets associated with a protection against apoptosis. Also, a decreased expression of stress-related genes (mcp1, hsp70) was evidenced. ldh mRNA levels were down-regulated in PFC-Biodritin microencapsulated islets but upregulated in the presence of LN. Increased levels of insulin mRNA were observed. The differences seen in protein expression indicated the same anti-apoptotic pattern. Caspase3 activity was not different between groups. Concerning diabetes reversal experiments, only mice transplanted with LN-Biodritin microencapsulated islets presented a better outcome, with 60% remaining euglycemic at 198 days post-surgery, compared with 9% for the Biodritin group. OGTT showed that mice transplanted with encapsulated islets secreted more insulin than normal mice, 60 (LN-Biodritin) or 100 days (PFC- and LN-Biodritina) posttransplant. Hyperglycemia was achieved after the retrieval of microcapsules showing graft efficacy. Retrieved microcapsules revealed an extensive overgrowth in most beads from hyperglycemic mice. A static glucose stimulated insulin secretion test revealed that only islets from normoglycemic subjects were able to secrete insulin according to glucose concentration. Conclusion- The addition of bioactive molecules to Biodritin may lessen the stress of isolated islets and have the potential to improve islet transplantation therapy.

Carcinoma de nasofaringe: análise da importância prognóstica da imunoexpressão da galectina-3 e proteínas de matriz / Nasopharynx Carcinoma: Analyse of the prognostic importance of the immunoexpression of galactin-3 and matrix proteins

Objetivo: Estudar a expressão da Galectina-3 e a distribuiçãodas proteínas de matriz, laminina, fibronectina e colágeno IV,em 30 amostras teciduais de carcinoma de nasofaringe (CNF)e correlacionar com as características clinicopatológicas,agressividade tumoral e sobrevida dos indivíduos. Forma deestudo: clínico retrospectivo. Material: Foram estudadas pormétodo imunohistoquímico a expressão das proteínas de matrize a galectina-3 de 30 amostras teciduais de 26 pacientes comdiagnóstico de Carcinoma de Nasofaringe. Resultados: A análisemostrou que a media etária foi de 48 anos, com o pico de prevalênciaentre 60 a 69 anos, e predominância do sexo masculino de 2:1. OCarcinoma Escamoso Não Ceratinizante Indiferenciado foi maiscomum em 23 amostras (76,7%), o Carcinoma Escamoso NãoCeratinizante Diferenciado em 4 amostras (13.3%) e CarcinomaEscamoso Ceratinizante em 3 amostras (10,0%). A expressãoda laminina que normalmente é restrita à parede dos vasos e nalâmina própria, estava muito aumentada na matriz das célulasneoplásicas em 23 amostras (76,7%); a fibronectina foi positivaem 13 amostras (43%) e a galectina-3 foi positiva em 21 amostras(70%). Tivemos correlação positiva da laminina, fibronectina egalectina-3 em 7 amostras (23,3%) e entre laminina e galectina-3em 11amostras (36,6%). Conclusão: A expressão positiva daGalectina-3 e da laminina não mostrou correlação significativaquanto à agressividade tumoral e a sobrevida dos pacientes,enquanto a expressão da fibronectina está associada a menortaxas de recidiva tumoral.

Carcinoma de nasofaringe: análise da importância prognóstica da imunoexpressão da galectina-3 e proteínas de matriz / Nasopharyns carcinoma: analysis of prognostic importance of immunoexpression of galectin-3 and matrix proteins

Objetivo: Estudar a expressão da Galectina-3 e a distribuição das proteínas de matriz, laminina, fibronectina e colágeno IV, em 30 amostras teciduais de carcinoma de nasofaringe (CNF) e correlacionar com as características clínicopatológicas, agressividade tumoral e sobrevida dos indivíduos. Forma de estudo: clínico retrospectivo. Casuística e Material: Foram estudadas por método imunohistoquímico 30 amostras teciduais de 26 pacientes com diagnóstico de Carcinoma de Nasofaringe (CNF), cujos blocos parafinados estavam arquivados no Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. As lâminas foram revisadas e reclassificadas de acordo com a classificação de 2005 da WHO. As proteínas de matriz e a galectina-3 foram analisadas por método imunohistoquímico. Resultado: A análise mostrou que a media etária foi de 48anos, com o pico de prevalência entre 60 a 69 anos, e predominância do sexo masculino de 2:1. O Carcinoma Escamoso Não Ceratinizante Indiferenciado (CENCI) foi mais comuns em 23 amostras (76,7%), o Carcinoma Escamoso Não Ceratinizante Diferenciado (CENCD) em 4 amostras (13.3%) e Carcinoma Escamoso Ceratinizante (CEC) em 3 amostras (10,0%). A expressão da laminina que normalmente é restrita à parede dos vasos e na lâmina própria, estava muito aumentada na matriz das células neoplásicas em 23 amostras (76,7%); a fibronectina foi positiva em 13 amostras (43%) e a galectina-3 foi positiva em 21 amostras (70%). Tivemos correlação positiva da laminina, fibronectina e galectina-3 em 7 amostras (23,3%) e entre laminina e galectina-3 em 11amostras (36,6%)...

Objectives: Analyze the expression of galectin-3 and distribution of matrix proteins, laminin, fibronectin and collagen IV, in 30 paraffinated samples of nasopharynx carcinoma(NFC); and correlate the to clinicopathological characteristics, as tumor aggressiveness and survival of individuals. Study design: retrospective clinical study. Methods: The analyses were performed by immunohistochemistry in 30 tissue samples of 26 patients diagnosed with NPC were archived in the Pathology Department of Botucatu of Medical School, São Paulo State University, UNESP, Brazil. The slides were reviewed and reclassified according to the WHO classification of 2005. The matrix proteins and galectin-3 analyses were performed by immunohistochemistry. Results: The analysis showed that the patients mean age was 48 years-old, with the age peak prevalence was from 60 to 69 years-old, with male predominance of 2:1. The undifferentiated non-keratinized squamous cell carcinoma (UNKSCC) was predominant in 23 samples (79%), differentiated non-keratinized squamous cell carcinoma (DNKCC) was found in 4 samples (13.3%) and keratinized squamous cell carcinoma (KCC) was found in 3 samples (10%). The laminin expression, which is normally restricted to the vessel walls and lamina propria, was increased in the neoplasic cell matrix in 23 samples (76.7%). Fibronectin was positive in 23 samples (43%). Galectin-3 was observed in 21 samples (70%). Seven cases showed positive correlation between all three proteins. Eleven cases presented positive correlation of laminin and galectin-3 immunoexpression. There was one case of KCC in recurrence of DNKCC...

Imunomapeamento nas epidermólises bolhosas hereditárias / Immunological mapping in hereditary epidermolysis bullosa

O imunomapeamento, uma técnica de imunofluorescência, é o método atual mais utilizado para o diagnóstico laboratorial e a diferenciação dos principais tipos de epidermólise bolhosa hereditária, uma vez que determina o plano de clivagem na junção dermo-epidérmica das doenças mecano-bolhosas.

Immunological mapping, an immunofluorescence technique, is currently the method most used to diagnose and differentiate the principal types of hereditary epidermolysis bullosa, since this technique is capable of determining the level of cleavage of this mechanobullous disease.

Edema de Reinke: estudo da imunoexpressão da fibronectina, da laminina e do colágeno IV em 60 casos por meio de técnicas imunoistoquímicas / Reinkes'edema: immunoexpression study of fibronectin, laminin and colagen IV in 60 cases by imunohistochemical techniques

Edema de Reinke é doença crônica da laringe na qual a camada superficial da lâmina própria é expandida por muco espesso conferindo-lhe aspecto gelatinoso. Relaciona-se ao tabagismo e acomete, preferencialmente mulheres, as quais apresentam a voz mais grave. Suas características histológicas nem sempre conseguem diferenciá-lo das demais lesões benignas da laringe, havendo necessidade de técnicas histológicas adicionais. Objetivos: Estudar a imunoexpressão da fibronectina, do colágeno IV e da laminina no edema de Reinke por meio de técnicas imunoistoquímicas. Estudo prospectivo. Material e métodos: Blocos histológicos de 60 casos cirúrgicos de edema de Reinke foram resgatados, submetidos a novos cortes e às reações imunoistoquímicas para fibronectina, laminina e colágeno IV pelo método da Avidina Biotina Peroxidase. Todos os pacientes eram fumantes e adultos, sendo 50 mulheres e 10 homens. Resultados: As análises da imunoexpressão da fibronectina, do colágeno IV e da laminina foram mais expressivas no endotélio dos vasos (68,33 por cento, 76,66 por cento, 73,33 por cento, respectivamente), e menos relevantes na membrana basal (25,0 por cento, 5,0 por cento e 3,3 por cento, respectivamente). Conclusões: No edema de Reinke, a imunoexpressão da fibronectina, da laminina e do colágeno IV na membrana basal não apresentam relevância, havendo predomínio desses anticorpos no endotélio do vasos.

Reinke's edema is chronic laryngeal disease in which the superficial layer of the lamina propria is expanded by thick mucus, giving it a gelatin aspect. The disease is directly related to smoking and more frequent in women, who end up having a lower tone of voice. Its histological characteristics cannot always distinguish it from other benign lesions of the larynx for which additional histological techniques are necessary. AIM: to study the immunoexpression of fibronectin, collagen IV and laminin in Reinke's edema by immunohistochemical technique. Prospective study. Materials and methods: histological blocks of 60 cases of surgical Reinke's edema were saved, submitted to new cross-sections and to immunohistochemical reactions for fibronectin, laminin and collagen IV by the Avidin-Biotin-Peroxidase method. Fragments of five normal vocal folds were used as control, removed during autopsy. All patients were chronic smokers and adults- 50 women and 10 men. Results: the immunoexpression of fibronectin, collagen IV and laminin was more important in the endothelium of blood vessels (68.33 percent, 76.66 percent, 73.33 percent, respectively) and less relevant in the basement membrane (25.0 percent, 5.0 percent and 3.3 percent, respectively). Conclusions: the immunoexpression of fibronectin, laminin and of collagen IV in the basal membrane of Reinke's edema was not relevant, with a predominance of these antibodies in the endothelium of blood vessels.

Avaliação da expressão de PrPc na interação neurônio-glia, em astrócitos e os mecanismos de secreção de STI1 / Avaliation of PrPc expression in neuron-glia crosstalk, in astrocytes and the mechanisms of STI1 secretion

As funções fisiológicas da proteína prion (PrPc) estão sob ampla investigação e caracterização, especialmente as funções associadas ao desenvolvimento cerebral. Destaca-se que a associação de PrPc com Stress Inducible Protein 1 (STI1), induz neuritogênese e neuroproteção via proteína cinase extracelular reguladora (ERK) e proteína cinase dependente de AMPc (PKA) respectivamente. O presente estudo avaliou como a expressão de PrP cem astrócitos pode modular a interação neurônioglia e o papel de STI1 como um fator autócrino em astrócitos. PrPc modula a interação neurônio-glia, a produção de fatores tróficos solúveis e a organização da laminina secretada na matriz extracelular pelos astrócitos. Desta forma, a expressão de PrP ctanto em astrócitos quanto em neurônios é essencial para a neuritogênese e sobrevivência neuronal. O papel autócrino de STI1 em astrócitos também foi demonstrado. A interação PrPc-STI1 previne a morte celular por ativação da via de PKA, e ativa a diferenciação astrocitária, de uma forma protoplasmática para uma fibrosa pela indução de ERK1/2. De acordo com estes resultados, um menor grau de diferenciação é encontrado em camundongos deficientes para PrPc...

The physiological functions of PrPc are under intense investigation and characterization, particularly those associated with brain development. In neurons, the association of PrPc with its ligand, STI1, induces neuritogenesis and neuroprotection via ERK and PKA signaling pathways, respectively. The present study evaluated whether PrPc expression in astrocytes modulates neuron-glia crosstalk and the autocrine role of STI1 in astrocytes. PrPc modulates neuron-glia interaction, the production and secretion of soluble factors, and the organization of the laminin in the extracellular matrix. PrPc expression in neurons and astrocytes is essential to neuritogenesis and neuronal survival. The autocrine role of STI1 in astrocytes was also demonstrated. The PrPc-STI1 interaction prevents cell death in a PKA-dependent manner, and induces astrocyte differentiation, from a flat to a process-bearing morphology in an ERK1/2 dependent manner. We showed that PrPccnull astrocytes presented a slower rate of astrocyte maturation than wild-type ones, with reduced expression of GFAP and increased vimentin and nestin expression...

Expressão da laminina na membrana basal em carcinoma escamocelular oral / Expression of basement membrane laminin in oral squamous cell carcinomas

A membrana basal é uma estrutura dinâmica que sofre modificações qualitativas e quantitativas durante a progressão do carcinoma escamocelular, e este processo é de fundamental importância na invasão neoplásica e metástase. OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi investigar o comportamento da membrana basal em carcinomas escamocelulares de boca com diferentes graus de malignidade histológica através da expressão imuno-histoquímica da laminina. FORMA DE ESTUDO: Coorte histórica com corte transversal. MATERIAL E MÉTODO: Trinta e um casos de carcinoma escamocelular de boca foram submetidos à graduação histológica para tumores malignos. Através do método da streptavidina-biotina, foi verificada a expressão imuno-histoquímica da laminina em relação à sua intensidade e integridade nas lesões com diferentes graus de malignidade. RESULTADOS: Foram observadas diferenças estatisticamente significativas dos valores médios da intensidade e da continuidade de marcação da laminina em relação aos diferentes graus de malignidade. CONCLUSÃO: Ficou demonstrado que a laminina, uma glicoproteína presente na membrana basal, sofreu modificações diferenciadas em carcinomas escamocelulares de boca nos diferentes graus de malignidade histológica.

The basement membrane is a dynamic structure that undergoes quantitative and qualitative changes during the progression of squamous cell carcinoma, which is essencially important in tumoral invasion and metastasis. AIM: This study is aimed at investigating the behavior of the basement membrane in oral squamous cell carcinomas with different malignancy scores, which were obtained through the immunohistochemical expression of the laminin, a glycoprotein present in the basement membrane. STUDY DESING: History cross-sectional cohort. MATERIAL AND METHOD: Thirty-one cases of oral squamous cell carcinoma were subjected to histological grading of malignant tumors. The immunohistochemical expression of the laminin in lesions bearing different scores of malignancy was evaluated according to intensity and integrity, using the Streptavidin-Biotin complex method. RESULTS: We noticed significant differences in the media between intensity and continuity laminin expression in relation to different grades of malignancy. CONCLUSION: Different expressions of laminin, a glycoprotein present in basement membranes were evident in oral cell carcinomas within different grades of histological malignancy.

Expresión de laminina en la microvasculatura de lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal

Las lesiones premalignas y malignas de la mucosa bucal representan un modelo para el estudio de la progresión tumoral. La degradación de los componentes de la matriz extracelular y de la membrana basal durante los procesos neoplásicos puede activar moléculas que actúan como promotoras o supresoras de la angiogénesis tumoral. La laminina es la glicoproteína estructural más abundante en la membrana basal, la cual esta constituida por tres subunidades polipeptídicas α, β, y γ, unidas por puentes disulfuro en una estructura cruciforme. La laminina en la membrana basal vascular cumple un papel crucial en la progresión del cáncer. En el presente estudio se determinó la expresión de laminina en la membrana basal vascular, en biopsias con diferentes grados de displasia y carcinomas bucales. Los resultados revelaron un aumento en la expresión de laminina en las células epiteliales y tumorales, así como también, alteraciones morfológicas en los vasos sanguíneos con la progresión tumoral. Estos hallazgos sugieren cambios a nivel estructural y funcional que pueden estar relacionados con los procesos de angiogénesis, invasión y metástasis.

Abstract Premalignant and malignant lesions in the oral mucosa represent a model for the study of tumoral progression. The degradation of the extracellular matrix and basement membrane components during neoplastic process can activate molecules that act as promoters or suppressors of tumoral angiogenesis. Laminin is the most abundant structural glycoprotein of basement membrane, composed by three polypeptides subunits α, β, and γ, disulfide-bonded in a cruciform structure. Laminin in the vascular basement membrane play a crucial role in the cancer progression. In the present study we determined the laminin expression in the vascular basement membrane, in biopsies with differents grade of dysplasia and squamous carcinomas. Results revealed an increase in the expression of laminin in the epithelial and tumoral cells, as well as morphologic alterations in the blood vessels with the tumoral progression. These findings suggest changes at structural and functional level that could be related with the process of angiogenesis, invasion and metastasis.